李雪芳，戴绚丽
高效液相色谱法作为食品中防腐剂检测的标准方法，广泛地用于各种饮料，食品以及各种原辅料的质量控制中[1, 2, 3 ]。但是对于基质较为复杂的样品，如酱油、酱包、桂圆肉、乳酸链球菌素等，我们以往的预处理方法是：对于酱包/浓缩汁，用水稀释后，加热超声萃取，离心去除油层后上过滤，再进样分析。对于酱油样品，稀释过滤后直接进样分析。对于乳酸链球菌素，用水稀释，超声，离心过滤后进样分析。该预处理方法简单，但是由于样品中存在色素，蛋白质，脂肪等多种干扰物质，上述预处理方法无法将干扰物质去除干净，使得苯甲酸和山梨酸与存在的多种干扰物质在色谱柱很难分离，因此很难获得满意的检测结果。同时，大量的杂质对色谱柱会造成污染，严重影响色谱柱的性能[4, 5]。为此我们根据苯甲酸和山梨酸在酸性条件下能同水蒸气一起蒸馏出来的特点[6]，采用水蒸气蒸馏法，用BUCHI 自动定氮仪对样品进行预处理，探讨了不同蒸馏条件下对检测结果的影响，建立了一种对复杂基质食品中防腐剂适用的简单、快捷的前处理方法。
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
1.1.1 主要试剂
甲醇，乙腈为色谱纯
乙酸铵溶液(0.02mol/L)：称取1.54g 乙酸铵(优级纯)，加水至1000ml，溶解，经滤膜(0.45μm)
过滤。
苯甲酸标准工作液：将1mg/ml 苯甲酸储备液稀释1000 倍作为工作液。
山梨酸标准工作液：将1mg/ml 山梨酸储备液稀释1000 倍作为工作液。
1.1.2 主要仪器
Waters 高效液相色谱仪
BUCHI 自动蒸馏仪
1.2 色谱条件
色谱柱：Aglient Zorbax Eclipse XDB-C18 4.6x150mm；
流动相：乙酸铵溶液:甲醇=90:10 流速：1.0ml/min
检测器：二极管阵列检测器 进样量：20μL
检测波长： 苯甲酸230nm 山梨酸254nm
1.3 色谱条件
准确称取10.00g 均匀样品，置于蒸馏管内，加磷酸1ml，无水硫酸钠20g，水15ml，在接受瓶中加入320μL1mol/L 氢氧化钠，加入少量蒸馏水。BUCHI 自动蒸馏仪蒸馏强度100%蒸馏5min，收集馏出液，用水定容到200ml，馏份经0.45μm 滤膜过滤后进样。
1.4 定量方法
根据保留时间定性，外标峰面积法定量。
2 结果与分析
2.1 不同前处理方法检测结果的比较
图1(a)和1(b)为不同前处理方法对酱包样品处理后所得的色谱图。图2(a)和1(b)为不同前处理方法对乳酸链球菌素样品处理后所得的色谱图。图1(a)和图2(a)的预处理方法为我们以往使用的预处理方法。图1(b)和图2(b)的预处理方法为本文提出的水蒸气蒸馏法。从图中可以看出，用以前的超声萃取方法检测酱包中的苯甲酸时，由于其基质复杂，干扰成分较多、黏度较高，造成了进样后杂质峰过多，色谱峰分离度无法满足要求，即使用200mm 色谱柱，用梯度洗脱，也无法将防腐剂与污染物质完全分离。而采用水蒸气蒸馏处理后，样品能完全被净化，基本无基质干扰，因此用150mm 色谱柱，5min 内就可将苯甲酸和山梨酸完全分离，因此可以满足大批量样品的快速测定。另一方面，由于蒸馏后上机测试的样品较干净，因此在实际的分析测试中，可以加大进样量，进一步降低方法的检测限。
2.2 前处理条件的优化
2.2.1 蒸馏强度的选择
蒸馏强度对苯甲酸和山梨酸的蒸发程度存在一定影响，本实验考察了不同蒸馏强度对苯甲酸和山梨酸回收率的影响，结果如表1。
随着蒸馏强度的增大，苯甲酸和山梨酸的蒸出率不断增大。因此，选择选择蒸馏强度100%。
2.2.2 无水硫酸钠加入量的影响
加入无水硫酸钠的目的是使样品溶液的沸点升高，从而使苯甲酸和山梨酸尽可能蒸馏出来。加入不同量的无水硫酸钠做加标回收试验，结果见表2。
从上表可以看出，无水硫酸钠的加入量对回收率有较大的影响，但当无水硫酸钠的加入量达到20g 后，苯甲酸和山梨酸的回收率增加不明显。 因此选择无水硫酸钠的加入量为20g。
2.2.3 磷酸加入量对回收率的影响
山梨酸和苯甲酸可能以山梨酸盐和苯甲酸盐的形式存在于样品中,加入磷酸的目的是使样品酸化，使防腐剂从盐的形式完全转化为酸的形式从而能随水蒸气蒸馏出来。考察了不同体积的磷酸加入量对结果的影响，结果见表3。
在实验中发现，加入磷酸的量增加,山梨酸和苯甲酸的回收率增加,当加入磷酸量增加到1ml后，进一步增加酸度山梨酸和苯甲酸的回收率增加不明显。
2.2.4 氢氧化钠吸收液加入量的选择
调节接受液的pH 值会影响苯甲酸和山梨酸的在水中的吸收效率。实验考察了接受瓶中加入不同量1mol/L 氢氧化钠溶液对苯甲酸和山梨酸回收率的影响，结果见表4。
随着氢氧化钠加入量的增加，吸收液的PH 升高，苯甲酸和山梨酸的吸收效率增加，当氢氧化钠加入量到320 ul 时，回收率可达到要求，因此选择加入1mol/L 氢氧化钠320 ul。
2.3 方法的定量限，重现性及回收率考察
取样品按本方法进行预处理后测定，以信躁比10，确定了该方法的定量限分别为苯甲酸0.035mg/L；山梨酸0.01mg/L。
对同一样品按本方法平行测定6 次，测定结果如表5 所示。
从表中结果可以看出，采用该方法，苯甲酸和山梨酸测定的相对标准偏差均小于10%，这一结果说明了本方法具有很好的重现性，测定结果可靠。
用水蒸气蒸馏法处理乳酸链球菌素，计算回收率，测定结果如表6 所示。
3 结论
本研究针对复杂样品中防腐剂测定过程中存在的基质严重干扰的问题，采用在酸性条件下水蒸气蒸馏法进行前处理，对样品进行净化，建立了高效液相色谱测定复杂基质样品中防腐剂的方法。通过实验确立了最佳的前处理条件以及色谱条件。该方法简便、快速，且重现性好，回收率可达到80%以上，能够用于日常分析检测。
