牛奶和奶粉中a-群勃龙、β-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮残留量的测定

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

8.2.3.1 适用范围

适用于牛奶和奶粉中a-群勃龙、β-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮残留量的高效液相色谱-串联质谱测定。方法检出限：牛奶中a-群勃龙、β-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮为1μg/kg，奶粉中a-群勃龙、β-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮为5μg/kg。

8.2.3.2 方法原理

试样在pH5.0条件下加酶水解，乙腈-乙酸乙酯提取，凝胶色谱净化，用高效液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。

8.2.3.3 试剂和材料

乙腈、乙酸乙酯、环已烷、甲醇、乙酸均为液相色谱纯；乙酸钠：分析纯；无水硫酸钠：分析纯：经650℃灼烧4h，置于干燥器内备用。

β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶：β-glucuronidase/arylsulfatase，100000unit/mL。

0.02mol/L乙酸钠缓冲液(pH=5.0)：称取无水乙酸钠0.82g溶于500mL水中，用乙酸调节pH=5.0。甲醇溶液(7+3，v/v)：30体积的水与70体积的甲醇混匀。乙酸乙酯-环己烷(1+1，v/v)：50体积的乙酸乙酯与50体积的环己烷混匀。

a-群勃龙、β-群勃龙(β-trenbolone，CAS：10161-33-8)、19-乙烯去甲睾酮(nortestosterone，CAS：434-22-0)和epi-19-乙烯去甲睾酮(epi-nortestosterone，CAS：4409-34-1)标准品：纯度大于或等于98%。

标准储备液：分别精确称取适量标准品，用乙腈配制成100μg/mL的标准储备液。

混合标准中间工作液：取标准储备液各1mL至100mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成混合标准工作液，浓度为1ug/mL。

8.2.3.4 仪器和设备

高效液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)。凝胶色谱仪。分析天平：感量0.1mg和0.01g。离心机。恒温水浴摇床。涡旋混合器。旋转蒸发仪。

8.2.3.5 样品前处理

(1) 试样制备

a.牛奶取均匀样品约250g装入洁净容器作为试样，密封置4℃下保存，并标明标记。

b.奶粉取均匀样品约250g装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。

(2) 提取

牛奶样品称取约5g(准确至0.01g)于50mL具塞离心管中，奶粉样品称取约1g(准确至0.01g)并加入5mL水于50mL具塞离心管中，混匀。

在称取好样品的离心管中加入5mL乙酸钠缓冲液和20μL β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，摇匀后盖好塞子置于恒温水浴摇床上，37℃振荡水解过夜。待水解液冷却至室温后，首先加入5mL乙腈，振摇，以沉淀蛋白，然后再加入20mL乙酸乙酯，蜗旋振荡提取2min后，3000r/min离心10min，移取上清液通过5g无水硫酸钠过滤至鸡心瓶中。再用20mL乙酸乙酯重复提取一次，合并上清液于同一鸡心瓶中。

(3)净化

1)凝胶色谱条件

净化柱：22gS-X3 Bio-Beads填料，200mm×25mm(内径)或相当者：流动相：乙酸乙酯-环已烷，流速：5.0mL/min；定量环：5mL；净化程序：0～10min弃去洗脱液，10～15.5min收集洗脱液。

2)凝胶色谱净化

将提取液在45℃下蒸至近干，用乙酸乙酯-环已烷(50+50，v/v)定容至10mL的玻璃试管中，按上述条件净化。净化后将收集的洗脱液蒸干，用1mL甲醇-水旋涡振荡溶解，过0.45μm滤膜供HPLC-MS/MS分析。

(4)空白基质溶液的制备

将取牛奶阴性样品Sg，奶粉阴性样品1g(精确到0.01g)，按上述提取净化步骤操作。

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