硝基呋喃类代谢物最大允许残留分析技术——测定方法（二）

时间：2023-03-25 05:40:31来源：food栏目：食品快速检测阅读：

硝基呋喃类代谢物最大允许残留分析技术——测定方法（二）

[db:作者] / 2022-12-12 00:00

(3)液相色谱-质谱联用法(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)

LC-MS串联技术拥有高效的分离能力，出色的检测灵敏度和较强的克服杂质干扰能力，是目前测定NFs代谢物最主要的技术手段，而LC-MS/MS则是最常用的方法。

1)液相色谱-单级质谱法(LC-MS)

LC-MS是将单四极杆质谱仪作为一种检测器与LC连接，是LC-MS仪的早期产品。与LC-MS/MS相比，在灵敏度和选择性上都要相差不少，主要用在NFs及其代谢物检测技术的早期开发上。

1996年Horne等开发了AOZ和AMOZ的LC-MS检测方法。用邻硝基苯甲醛衍生，经LLP后，用LC-MS测定，肝脏样品的检测限为10μg/kg。朱坚建立了鸡肉和虾中AOZ和AMOZ残留量的LC-MS测定方法。样品用酸水解，邻氯苯甲醛衍生化，经SPE柱净化后，用LC-MS检测。在电喷雾电离(ESI)正离子、选择离子监测(SIM)模式下，方法检测低限为0.3×10-9数量级。林黎明等建立了鸡组织及蛋中4种NFs代谢产物的LC-MS方法。用AMOZ-d5，AOZ-d4作内标，经ENSPE柱净化，以乙腈-0.1%甲酸为流动相，采用梯度洗脱，可在15min内将4种代谢产物完全分离并进行测定。方法回收率为85%～90%，检出限可达0.5μg/kg。徐维海等采用LC-MS方法研究呋喃唑酮及其代谢产物AOZ在罗非鱼体内的残留规律。在大气压化学电离源(APCI)电离模式下，呋喃唑酮及其代谢物AOZ的检出限分别为10μg/kg和1μg/kg。

2)液相色谱-质谱/质谱法(LC-MS/MS)

由于出色的灵敏度、选择性，而且还能够提供禁用药物确证所需的结构信息，LC-MS/MS已成为NFs代谢物检测最常用的方法，也是大多数国家和组织认可的方法。

A.组织样品分析

Alexander等首次报道用LC-MS/MS同时分析动物肌肉组织中4种NFs代谢物的方法。分析物被酸性水解，后从组织中释放，用2-硝基苯甲醛衍生化，利用SPE净化样品，LC-MS/MS在ESI正离子、MRM模式下检测。4种NFs代谢物AOZ、AMOZ、SEM、AHD的LOD分别为0.5ng/g、0.5ng/g、3.0ng/g、5.0ng/g，LOQ分别为2.5ng/g、2.5ng/g、10.0ng/g、10.0ng/g，测定响应值的线性范围从检测限到800ng/g之间。彭涛等也率先在国内报道了用LC-MS/MS测定动物组织中NFs代谢物的方法。盐酸水解组织中蛋白结合代谢物，同时加入2-硝基苯甲醛，37℃过夜衍生。上清液调pH7.0后，用OasisHLB柱净化。采用ESI电离，正离子，选择反应监测(SRM)模式检测。三离子原则，外标法定量。LOQ为AMOZ、AOZ 0.1ng/g，SEM、AHD 0.5ng/g；LOD为AMOZ、AOZ 0.05ng/g，SEM、AHD 0.1ng/g，低于欧盟规定的1μg/kg的方法灵敏度要求。在添加浓度0.5～10ng/g范围内，AMOZ回收率为65.4%～91.3%，SEM回收率为62.7%～94.6%，AHD回收率为63.9%～89.4%，AOZ回收率为67.8%～90.9%，RSD均小于4.8%。庞国芳等建立了用LC-MS/MS测定禽肉组织中AOZ、AMOZ、SEM和AHD4种NFs代谢物的方法。0.2mol/L盐酸水解禽肉组织中与蛋白结合的NFs代谢物，用2-硝基苯甲醛37℃衍生16h。上清液调pH7.4后，用LiChrolutEN柱净化，乙酸乙酯洗脱，流动相定容。采用ESI电离，正离子扫描，MRM模式检测。标准曲线用空白禽肉样品添加标准与样品同步操作获得，并用其进行外标定量。在添加浓度0.5～10μg/kg范围内，4种代谢物的平均回收率在70.2%～89.1%之间；LOD为AMOZ、AOZ0.1 μg/kg，SEM、AHD0.2μg/kg；4种代谢物LOQ均为0.5μg/kg；10次测定结果RSD在5.59%～10.10%之间。Verdon等采用LC-MS/MS方法，测定了火鸡肌肉中的5种NFs(呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、硝呋柳肼)的代谢产物SEM、AOZ、AMOZ、AHD、DNSAH。将水解、衍生的过程从37℃ 16h缩短至55℃ 4h，结果表明对测定并无显著影响。采用乙酸乙酯提取，内标法定量，由于DNSAH暂无同位素内标，采用由另一化合物硝呋酚酰肼得到的水杨酸肼作为内标校正。该方法同样适用于其他家禽肌肉、蜂蜜、鸡蛋和猪组织，LOQ均低于0.5μg/kg。Bock等验证了检测鸡肉和虾肉中的4种NFs代谢物的确证方法，并进行了不确定度评价。方法用稳定同位素标记的代谢物进行内标法定量，不同的样品基质以及样品状态(新鲜或者冻干样品)均会导致内标的回收率发生变化，从而影响方法的准确度，因此需要同时应用内标和基质标准曲线才能实现准确定量。在稳定性试验中，样品可以在-25℃下保存12个月。方法的CCa为0.1～0.7μg/kg，CCβ为0.1～0.9μg/kg，CV在7%～17%之间。赵善仓等开发了畜产品中4种NFs代谢物残留的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)快速检测方法。样品经衍生化后，用乙酸乙酯提取，正己烷净化，流动相定容。采用ESI电离，正离子扫描，MRM方式采集数据，外标法定量。在添加浓度为0.1～2.0ug/kg范围内，4种代谢物的平均回收率在67.3%～85.0%之间，10次测定结果的CV在2.0%～9.7%之间；最低检出限均达到0.15μg/kg；在0.1～20.0ng/mL的线性范围内，相关系数r均大于0.99。实现了样品检测的快速和高灵敏，适用于猪肉和猪肝中NFs代谢物的残留检测。刘红卫等采用UPLC-MS/MS，ESI电离，正离子模式，对肠衣中4种NFs代谢物残留量进行定性定量检测。用甲醇、水脱脂去除部分杂质，经OasisHLB小柱富集净化后，用Waters ACQUITY UPLC TM BEH C18色谱柱分离，以0.3%乙酸乙腈溶液和0.3%乙酸溶液为流动相，梯度洗脱。在MRM模式下以保留时间和离子对(母离子和两个子离子)信息比较进行定性，以响应值高的子离子进行定量。该法的检出限为0.2～0.5μg/kg，加标回收率为86%～97%，RSD小于10%。

B.蜂产品分析

丁涛等报道了LC-MS/MS测定蜂王浆中呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮4种NFs代谢物残留的方法。以三氯乙酸作为蜂王浆的蛋白质沉淀剂，同时提供衍生化反应所需的酸性环境；使用4种同位素内标，补偿了衍生化效率、衍生后样品溶液的pH及光照对定量结果所产生的影响，极大地提高了定量的准确性。实验结果表明，呋喃它酮代谢物的LOD可以达到0.03μg/kg，其他3种代谢物可以达到0.05μg/kg(S/N大于5)；呋喃它酮代谢物的LOQ可以达到0.20μg/kg，其他3种代谢物可以达到0.25μg/kg(S/N大于10)；线性范围为0.4～20ng/mL，添加回收率为97.7%～104.8%(内标校正)，RSD为2.7%～9.7%。Khong等建立了检测蜂蜜中NFs代谢物的同位素稀释LC-MS/MS方法。HPLC分析柱为反相C18柱(150mm×2.1mm，3.5μm)，流动相为水(含0.025%的乙酸)和乙腈，采取线性梯度洗脱的方式，流速为0.3mL/min，分析物在正离子模式进行分析，ESI源，源温为300℃，毛细管电压为5.5kV，扫描模式为MRM。氘代化的NFs代谢物随样品一起衍生化，以内标法进行准确定量。NFs的检测灵敏度达到1.0μg/kg，在此浓度进行添加回收实验，回收率为82%～112%。AHD、AMOZ、AOZ、SEM的CCa分别为0.46μg/kg、0.07μg/kg、0.12μg/kg、0.36ug/kg，CCβ分别为0.56μg/kg、0.12μg/kg、0.18μg/kg、0.43μg/kg。在筛查市场上蜂蜜的用药情况时，100多个蜂蜜样品中的14%含有AOZ，21%含有SEM。余建新等采用微量化样品前处理技术，以邻硝基苯甲醛为衍生剂，ESI正离子、MRM方式建立了蜂蜜中4种NFs代谢物残留量同时测定的LC-MS/MS方法。方法的检出限为0.02～0.3ng/g，线性范围均大于102，线性方程的相关系数r大于0.997，回收率为79.0%～95.6%。

C.乳、蛋分析

彭涛等用LC-MS/MS法同时测定奶粉中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因的代谢物。盐酸水解奶粉中蛋白结合的代谢物，同时加入2-硝基苯甲醛，37℃过夜衍生化。加入硫酸锌，调pH7.0后，再加入亚铁氰化钾去除蛋白。然后用乙酸乙酯提取，正已烷净化，分析物采用ESI正离子、MRM模式检测，内标法定量。在添加浓度0.5～2μg/kg范围内，内标法回收率为89.5%～110.3%；RSD小于11.3%。AMOZ、AOZ的LOD为0.05μg/kg，SEM、AHD为0.1μg/kg。Chu等应用LC-MS/MS方法检测了牛奶中的NFs代谢物的残留量。液相色谱的流动相为甲醇和20mmol/L乙酸铵，串联质谱在APCI正离子模式下，应用MRM进行采集数据。每个监测离子对的驻留时间为150ms，离子源温度为350℃，离子喷雾电压为5.5kV。此方法中4种药物的回收率为83%～104%，CV均小于13%；AOZ、SEM、AHD和AMOZ的LOD分别为0.1ng/g、0.2ng/g、0.2ng/g、0.1ng/g，LOQ为0.2ng/g。

曹文卿等建立了蛋黄粉中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮等NFs代谢物残留的LC-MS/MS测定方法。利用硅藻土为基质分散剂对蛋黄粉进行基质分散，三氯乙酸溶液沉淀蛋白并提供水解环境，2-硝基苯甲醛衍生化，乙酸乙酯液液萃取等前处理手段对蛋黄粉中的硝基呋喃代谢产物进行了提取和净化，LC-MS/MS检测。方法测定低限为0.5μg/kg，线性范围为0.5～6.0μg/kg，室内验证回收率范围为90.06%～109.8%，RSD为2.0%～7.7%。Bock等建立了鸡蛋中NFs代谢物的LC-MS/MS方法，并进行了验证。AHD和SEM的CCa和CCβ均在0.2μg/kg左右，AMOZ的CCa和CCβ在0.05μg/kg左右，AOZ的CCa和CCβ低于0.05μg/kg。

D.血浆、血清分析

Radovnikovic等建立了UHPLC-MS/MS方法用于动物血浆中(牛、羊、马和猪)的4种NFs代谢物(AHD、AOZ、SEM、AMOZ)的确证检测。血浆样品用2-硝基苯甲醛衍生化，随后用有机溶剂萃取，萃取液浓缩，然后通过UHPLC-MS/MS分析。该方法根据欧盟委员会决议2002/657/EC进行了验证。AHD、AOZ、SEM和AMOZ的回收率分别为72%、74%、57%和71%；CCa分别为0.070μg/kg、0.059μg/kg、0.071μg/kg和0.054μg/kg。这种方法可作为农场兽药监控制的替代方法。Tai等应用LC-MS/MS测定了畜牧场及肉品市场猪血清中4种NFs药物代谢物残留。样品通过水解蛋白质键合的药物代谢物，并与2-硝基苯甲醛衍生化，通过乙酸乙酯LLP进行净化，然后将乙酸乙酯层用氮气流蒸发至干，将残余物重新溶解于50%甲醇溶液，0.22um过滤器过滤后，采用ZORBAX eclipse XDB-C18柱分离，ESI正离子模式电离，在MRM模式下进行LC-MS/MS分析。方法LOQ为0.2ppb；SEM、AOZ、AHD和AMOZ的回收率分别为75.0%～97.6%、90.0%～92.6%、92.0%～84.4%和94.0%～94.2%，其标准偏差分别为0.06、0.04、0.06和0.05；对950个样品进行了检测，其中2例样品中AOZ和AH和呈阳性，其测定的浓度范围为2.5～19.4ppb。

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