液相色谱-串联质谱法测定牛肝和牛肉中睾酮、表睾酮、孕酮残留量

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

8.2.1.1 适用范围

适用于牛肝和牛肉中睾酮、表睾酮、孕酮残留量的液相色谱-串联质谱测定。方法检出限：肝脏中睾酮、表睾酮、孕酮为0.5mg/kg，肌肉中睾酮、表睾酮为0.1mg/kg，孕酮为0.5mg/kg。

8.2.1.2 方法原理

牛肝和牛肉中的睾酮、表睾酮、孕酮药物残留经酶解后用甲醇叔丁基甲醚提取，提取液用C18固相萃取柱净化，肝脏样品需再经硅胶固相萃取柱净化，洗脱液浓缩定容后，供液相色谱-串联质谱测定。

8.2.1.3 试剂和材料

乙腈、甲醇、叔丁基甲醚、正已烷：色谱纯；三氯甲烷、甲酸铵：分析纯。

β-葡糖苷酸酶/硫酸酯酶：H-2型，Helixpomatia。磷酸盐缓冲液：1.0mol/L。称取13.6g磷酸二氢钾溶于100mL水中，称取8.7g磷酸氢二钾溶于50mL水中，分别取70mL磷酸二氢钾水溶液和28mL磷酸氢二钾水溶液，混匀后调节pH为5.0，置4℃中可保存1周。饱和氯化钠水溶液。水饱和乙酸乙酯。

睾酮、表睾酮、孕酮标准物质：纯度≥99%。氘代睾酮(d5-睾酮)、氘代孕酮(d9-孕酮)内标标准物质：纯度≥98%。

标准储备溶液：100μg/mL。准确称取适量的睾酮、表睾酮、孕酮标准物质，用甲醇分别配制成100μg/mL的标准储备溶液，-18℃贮存，可使用6个月。

标准工作溶液：5μg/mL。分别吸取5mL睾酮、表睾酮、孕酮标准储备溶液至100mL容量瓶中，以甲醇稀释并定容，此标准工作溶液的浓度为5μg/mL。-18℃贮存，可使用6个月。

混合标准工作溶液：50ug/L。分别吸取1.00mL睾酮、表睾酮、孕酮标准工作液至100mL容量瓶中，以甲醇稀释并定容，此混合工作溶液的浓度为50μg/L。-18℃贮存，可使用3个月。

内标储备溶液：100μg/mL。准确称取适量的氘代睾酮(ds-睾酮)、氘代孕酮(d9-孕酮)标准品，用甲醇分别配制成100μg/mL的内标储备溶液，-18℃贮存，可使用6个月。

内标工作溶液：5μg/mL。分别吸取5mL氘代睾酮(d5-睾酮)、氘代孕酮(d9-孕酮)内标储备溶液至100mL容量瓶中，以甲醇稀释并定容。-18℃贮存，可使用6个月。

内标混合工作溶液：25μg/L。分别吸取0.50mL氘代睾酮(d5-睾酮)、氘代孕酮(d9-孕酮)内标工作溶液至100mL容量瓶中，以甲醇稀释并定容。-18℃贮存，可使用3个月。

基质混合标准工作溶液：根据每种标准的灵敏度和仪器线性范围，吸取一定量的混合标准工作溶液和内标工作溶液，用空白样品提取液配成系列浓度的基质混合标准工作溶液。当天配制。

C18固相萃取柱：500mg，6mL。使用前依次用6mL甲醇、6mL水活化。硅胶固相萃取柱：200mg，6mL。使用前用6mL正已烷活化。

8.2.1.4 仪器和设备

液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源；分析天平：感量0.1mg和0.01g；匀质机；高速组织匀浆机；低温高速离心机：转速大于4000r/min；高速离心机：转速大于12000r/min；超声波；旋涡振荡器；振荡水浴；氮气浓缩仪；固相萃取装置；旋转蒸发器；KD浓缩瓶。

8.2.1.5 样品前处理

(1)试样制备

取样品约500g用组织捣碎机捣碎，装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。将试样于-18℃保存。

(2)酶解

准确称取5g试样，准确至0.01g，置于50mL离心管中，依次加入200μL内标混合工作溶液、10mL磷酸缓冲液，以14000r/min均质30s，加入60μL葡萄糖苷酸酶/硫酸酯酶，混匀30s，置于37℃恒温振荡水浴中酶解16h。

(3)提取

酶解后的样品溶液加10mL甲醇，混匀2min，置冰浴中放置5min，在5℃以4000r/min离心10min，上清液转移至50mL离心管中，下层沉淀再用5mL甲醇重复上述操作一次，合并上清液至上述50mL离心管中，向离心管中加入15mL叔丁基甲醚，振摇5min，以4000r/min离心5min，上层溶液转移至125mL分液漏斗中，下层溶液依次再用15mL、10mL叔丁基甲醚提取二次，合并上层溶液至上述分液漏斗中，加入10mL饱和氯化钠水溶液，振摇30s，静置分层，上层溶液转移至梨形瓶中，在40℃旋转蒸发至干，残渣中加入1.5mL甲醇，涡旋1min，超声5min，再加入20mL水，混匀，待净化。

(4)净化

将样品提取液转移至已活化的C18固相萃取柱上，用5mL水洗涤梨形瓶，洗涤液合并至C18固相萃取柱中，以≤2mL/min流速使样液通过固相萃取柱，待样液过柱后，用5mL水淋洗C18固相萃取柱，弃去淋洗液，用10mL甲醇将待测组分从C18固相萃取柱.上洗脱，洗脱液转移至梨形瓶中，在40℃旋转蒸发至干。肌肉样品用0.5mL甲醇溶解残渣，涡旋1min，加入0.5mL水混匀，过0.2um滤膜，供液相色谱串联质谱测定。

肝脏样品的洗脱液蒸干后，向梨形瓶中加入0.5mL三氯甲烷，涡旋1min，加入5mL正己烷，超声1min，然后转移至已活化的硅胶固相萃取柱中，以1mL/min流速使样液通过固相萃取柱，待样液过柱后，用5mL正己烷淋洗硅胶固相萃取柱，弃去淋洗液，用6mL水饱和乙酸乙酯洗脱待测组分，洗脱液转移至KD接收瓶中，在40℃旋转蒸发至干，加0.5mL甲醇，涡旋1min，加入0.5mL水混匀，过0.2um滤膜，供液相色谱一串联质谱测定。

称取阴性样品，按上述提取净化步骤制备空白样品提取液，用于配制系列基质混合标准工作溶液。

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