硝基呋喃类代谢物最大允许残留分析技术——测定方法（一）

[db:作者] / 2022-12-12 00:00

7.1.4.2 测定方法

在已经发表有关NFs残留检测方法的文献中，早期的报道大多数是检测原药。然而，由于NFs对光敏感，且具有代谢快速的特点，在动物体内的半衰期不过数小时，在动物组织中通常不太可能检出原药残留。因此，残留检测的标识物已经变为它们的代谢产物。目前，国内外报道的NFs代谢物残留检测方法主要有酶联免疫法(ELISA)、液相色谱法(LC)和液相色谱-质谱联用法(LC-MS)等。

(1)高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)

采用液相色谱检测NFs代谢物的报道很少，这是因为常规LC测定技术难以满足检测可食性组织中NFs代谢物的灵敏度要求，不过仍然可以用于方法学研究等。

Arancibia等建立了尿液中呋喃妥因及其代谢物的HPLC-UV检测方法。该方法使用SFE萃取尿液中呋喃妥因及其代谢物，以LC-18-DB(250mm×4.6mm，5um)为LC分析柱，流动相为乙腈-水(85+15，v/v)，流速为0.2mL/min，检测波长为310nm。呋喃妥因的保留时间为13.38min，其代谢物为10.20min；呋喃妥因的线性范围为10.9～378.0umol/L(R=0.9995)，其代谢物为3.0×10-3～21.0umol/L(R=0.9992)；检测限分别为12.1μmol/L和0.9umol/L。Chumanee等建立了虾肉中4种NFs代谢物残留的HPLC-DAD检测方法。20g虾肉样品在0.2mol/LHCl的酸性条件下，加入20mmol/L的NTA、0.12g NaOAc、1g KCl，37℃避光过夜反应。衍生化之后用乙酸乙酯提取，最后用正己烷LLP除脂。NTA衍生化的代谢物在ChromSpher 5 C18柱(250mm×4.6mm，5μm)上分离，乙腈-5mmol/L酸铵(pH7.5)作为流动相，流速为1mL/min，整个梯度洗脱程序时间为40min，洗脱顺序为：NTAHD<NTSEM<NTAOZ-<NTAMOZ，NTAHD的检测波长为310nm，其余为308nm。在1ug/kg、1.5μg/kg、2ug/kg三个浓度水平进行添加回收实验，回收率均高于86%，CV小于14%。AHD、AOZ、SEM、AMOZ的LOQ分别为0.7803μg/kg、0.7973μg/kg、0.6973ug/kg、0.9118μg/kg，LOD均在0.2ug/kg左右。该方法单纯应用LC技术，LOQ就能够达到1μg/kg以下，为NFs代谢物的检测提供了更多的选择。

(2)胶束动电毛细管色谱法(micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC)

Wickramanayake等首次建立了NFs及其代谢物(NFM)的胶束动电毛细管色谱测定方法。选用脱氧胆酸钠(SDC)作为形成胶束的表面活性剂，采取中央组合实验设计(CCD)的方法优化分离条件，对缓冲液中硼酸盐与磷酸的浓度比、运行电解质的pH、电压等实验参数进行优化。表面活性剂浓度对分辨率的影响是非常显著的。在优化条件下(80mmol/LSDC，pH9.0，20mmol/L硼酸盐+20mmol/L磷酸，16kV)，8对连续峰的分辨率在1.9～11.8之间。由于代谢物缺乏具备UV活性的发色团，采用2-NBA进行衍生化。为了模仿同时分析样品中NFs和衍生化NFM的提取程序，含水样品(用2-NBA预衍生)用C18 SPE柱富集。SPE柱经水洗涤后，用弱洗脱特性的小体积有机溶剂(正已烷)去除过量的2-NBA，分析物用乙腈洗脱。采用开发的方法，所有分析物迁移时间[t(mig)]的重现性都非常好，绝对t(mig)的RSD小于1%，t(mig)比率的RSD小于0.2%，峰面积比率的RSD为4%。所有化合物的LOD(S/N=3)在0.19～2.0μg/mL之间。

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