大环内酯类和林可胺类药物残留分析技术前处理方法——净化方法

时间：2023-03-25 05:47:42来源：food栏目：食品快速检测阅读：

大环内酯类和林可胺类药物残留分析技术前处理方法——净化方法

[db:作者] / 2022-12-12 00:00

(2)净化方法

兽药残留分析的净化步骤非常关键，通过净化起到去除生物样品中的脂肪、蛋白等干扰物质的目的，同时也可以提高检测灵敏度，延长仪器和色谱柱的寿命。MALs和林可胺类药物前处理过程中涉及的净化方法主要有液液分配、固相萃取、基质固相分散等。

1)液液分配(liquidliquidpartition，LLP)

LLP是利用待测组分与样品杂质在互不相溶的两种液体里溶解性不同而得到净化的一种方法。其优点是溶剂易得，而且价格便宜。但也存在一定的缺点，包括乳化现象的形成和待测物在两相中存在互相的溶解性。氯仿和二氯甲烷常用于从水或碱性溶液中萃取MALs，缺点在于毒性高且易污染环境。Draisci等利用磷酸盐缓冲液、水和氯仿进行牛组织中MALs药物的提取及LLP净化，经涡动离心后液体分为三层：上层为水相，中层为组织相，下层为氯仿相，收集下层进--步固相萃取净化后，进LC-MS/MS测定。方法回收率在80.4%～90.2%之间，RSD小于14.9%；LOQ在20～150μg/kg之间。

2)固相萃取(solidphaseextraction，SPE)

与LLP相比，SPE不需要使用大量有机溶剂，处理过程中不会产生乳化现象，能简化样品的处理过程，但是SPE柱的使用成本较高。尽管如此，SPE仍然是MALs和林可胺类药物样品净化中的主流技术。在MALs和林可胺类药物残留分析中，常用的SPE柱主要有基于反相机理的C18柱和HLB柱，以及基于离子交换机理的SCX柱和WCX柱等。从文献报道的结果来看，SCX柱和HLB柱对MALs和林可胺类药物的净化效果较好。

反相C18 SPE是许多中等或低极性药物常用的净化方法。Thompson等应用C18 SPE柱对蜂蜜中的泰乐菌素和林可霉素进行净化。C18柱用5mL甲醇和5mL水进行活化，蜂蜜首先与10mL的碳酸盐缓冲液进行混合稀释后.上柱，用4mL 5%的甲醇-水和4mL 70%的甲醇-水洗涤，再用甲醇和乙腈进行洗脱，浓缩后LC-MS检测。在0.01μg/g、0.5μg/g、10μg/g三个添加浓度水平，林可霉素和泰乐菌素的平均回收率为84%～107%；LOD为：泰乐菌素0.01ug/g，林可霉素0.007μg/g。陈明等报道了牛奶中克林霉素残留量的检测方法。牛奶样品用20%乙酸溶液和水超声振荡提取，离心后，上清液过C18固相萃取柱，用4mL水淋洗，再用6mL甲醇洗脱，经氮吹仪吹干后，用流动相溶解定容：至1mL，过0.22um滤膜后，进行HPLC分析。克林霉素浓度在1.0～10.0μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率为80.3%～93.9%，CV为1.23%～3.47%，LOD为0.5μg/mL。谢文等建立了蜂王浆中5种MALs残留量的HPLC方法，并对OasisHLB和C18固相萃取柱的净化效果进行了比较。首先使用HLB(3mL，60mg)和(6mL，500mg)两种规格的小柱，加入50ng混合标准溶液后，用甲醇-水(2+8，v/v)洗涤，虽可去除样品中色素等杂质，但结果显示MALs同时也被不同程度地洗脱下来，降低了方法回收率；同样条件用于C18柱，MALs损失率较小。因此该方法选用C18固相萃取柱进行净化。5种MALs在0.002～0.05mg/L范围内具有良好的线性关系，加标回收率和相对标准偏差较好。

HLB吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物。它以反相保留机理为主，并通过一个特殊的极性捕获基团来增加对极性物质的保留以提供较好的水浸润性。Adams等在蜂蜜样品中加入磷酸缓冲液，置于45℃水浴中10min，再涡旋以使蜂蜜均匀散开，用OasisHLB柱进行净化。SPE柱用甲醇和提取液活化，上样后用40%的甲醇洗涤，0.5%氨化乙腈洗脱，氮气吹干后复溶于50%的甲醇-水中检测，建立了蜂蜜中林可胺类药物的测定方法。刘正才等用OasisHLB固相萃取小柱对烤鳗中13种林可胺类和MALs进行净化。SPE柱先用甲醇和水活化，样品液流干后用5%甲醇洗涤，再用甲醇洗脱，吹干、复溶并过滤后，LC-MS/MS测定。研究者比较了HLB与C18萃取柱的净化和富集效果，发现前者相对较好，在0～100ug/L范围内，峰面积与质量浓度有良好的线性关系，相关系数大于0.99，在1.0μg/kg、2.0μg/kg、4.0μg/kg三个浓度水平进行添加回收实验，平均回收率为70.26%～124.22%，RSD为1.31%～16.00%。

由于MALs呈弱碱性，还可以采用基于阳离子交换机理的SPE柱净化。张敬平等用甲醇提取鸡肝中6种MALs，然后用BondElutSCX固相萃取柱净化，LC-MS检测。该方法的LOD为1～10μg/L，在0.05～0.7μg/mL范围内线性关系良好，相关系数大于0.996；在0.5μg/g、0.1μg/g两个添加水平下，回收率范围为78.5%～93.4%，RSD小于7.2%。该研究比较了三种不同保留机理的SPE柱对MALs的富集效果:反相保留机理的BondElut C18柱(100mg，1mL)和OasisHLB柱(200mg，3mL)，离子交换保留机理的BondElutSCX柱(500mg，3mL)，以及混合保留机理的BondElutPlexa柱(200mg，3mL)。结果表明SCX柱和HLB柱的保留效果较好，最终从净化效果考虑，选择SCX柱作为样品净化柱。

3) 基质固相分散萃取(matrixsolid-phasedispersion，MSPD)

MSPD的原理是将涂渍有C18等多种聚合物的担体固相萃取材料与样品一起研磨，得到半干状态的混合物并将其作为填料装柱，然后用不同的溶剂淋洗柱子，将各种待测物洗脱下来。其优点是浓缩了传统样品前处理中的样品匀化、组织细胞裂解、提取、净化等过程，不需要进行组织匀浆、沉淀、离心、pH调节和样品转移等操作步骤，避免了样品的损失，使分析者能同时制备、萃取和净化样品。Bogialli等的研究表明，对于MALs来说，热水可作为一种较好的萃取剂而避免了有机溶剂的使用，且不会影响方法的准确度。将牛奶分散于硅藻土中，最终目标分析物将在70℃加热的状态下通过30mmol/L的甲酸作用下经过MSPD柱洗脱下来，洗脱液经过pH值调节和过滤，可直接用HPLC分析测定，牛奶中MALs的回收率可达到68%～86%。Frenich等利用MSPD进行了鸡蛋中MALs的提取与净化处理，首先将0.5g鸡蛋与2g的C18担体材料进行玻璃杵均匀混合，直到均一黄色物质出现为止，然后装柱(含2g硅酸镁载体，并事先过夜加热至130℃活化处理)，经甲醇、乙腈、35%氨水-甲醇(0.04%，v/v)进行洗脱，最后氮吹浓缩后复溶后UPLC-MS/MS分析。方法回收率在60%～119%之间，RSD小于25%；LOQ小于等于5μg/kg。

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